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Broutin, Isabelle

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Works: 20 works in 25 publications in 2 languages and 30 library holdings
Roles: Opponent, Thesis advisor, Other, Author
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Most widely held works by Isabelle Broutin
AFFINEMENT DE LA STRUCTURE DE LA COLLAGENASE D'HYPODERMA LINEATUM A 1,8 A DE RESOLUTION by Isabelle Broutin( Book )

4 editions published in 1993 in French and held by 4 WorldCat member libraries worldwide

LES COLLAGENASES, SEULS ENZYMES DEGRADANT LE COLLAGENE DANS LES CONDITIONS PHYSIOLOGIQUES DE PH ET DE TEMPERATURE, JOUENT UN ROLE ESSENTIEL POUR L'EQUILIBRE DYNAMIQUE DU COLLAGENE DANS LE TISSU CONJONCTIF. ELLES APPARTIENNENT A DEUX FAMILLES, LES METALLO-PROTEASES ET LES PROTEASES A SERINE. LA COLLAGENASE QUE NOUS AVONS ETUDIEE APPARTIENT A CETTE DERNIERE. ELLE EST EXTRAITE DES PARASITES DU BETAIL HYPODERMA LINEATUM, RESPONSABLES DE L'HYPODERMOSE QUI AFFECTE CERTAINS MAMMIFERES ET PROVOQUE UNE BAISSE DES RENDEMENTS ZOOTECHNIQUES. LA COLLAGENASE D'HYPODERMA LINEATUM A UN POIDS MOLECULAIRE DE 25200 DALTONS POUR 230 ACIDES AMINES. ELLE CRISTALLISE DANS LE GROUPE D'ESPACE I422, EN PRESENCE DE SULFATE D'AMMONIUM A PH NEUTRE, EN ABSENCE D'INHIBITEUR. LES PARAMETRES DE MAILLE SONT A=111,7 A ET C=165,8 A AVEC DEUX MOLECULES PAR UNITE ASYMETRIQUE. ELLE EST INHIBEE PAR LE DIPF MAIS AUCUN INHIBITEUR PEPTIDIQUE N'EST CONNU A CE JOUR. AU DEBUT DE CETTE THESE ONT ETE COMMERCIALISES DES DETECTEURS BIDIMENSIONNELS. NOUS AVONS UTILISE LA COLLAGENASE COMME OUTIL DE CALIBRATION POUR TESTER LE FAST (ENRAF NONIUS), LE XENTRONICS (SIEMENS), ET ENFIN, LORSQU'IL FUT DISPONIBLE, LE PROTOTYPE MARK II (DETECTEUR REALISE A LURE PAR R. KAHN ET COL. EN COLLABORATION AVEC LE GROUPE DE G. CHARPAK AU CERN). NOUS AVONS EFFECTUE UNE ETUDE COMPARATIVE QUI MONTRE QUE LA QUALITE DES JEUX DE DONNEES OBTENUS A L'AIDE DE DETECTEURS COMMERCIAUX ET DE SOURCES CONVENTIONNELLES S'EST NETTEMENT AMELIOREE DURANT CES DERNIERES ANNEES TOUT COMME LES PROGRAMMES DE TRAITEMENT DU SIGNAL. POUR OBTENIR DES DONNEES A HAUTE RESOLUTION, L'UTILISATION CONJOINTE DU RAYONNEMENT SYNCHROTRON ET DU DETECTEUR PROTOTYPE MARK II RESTE LA REFERENCE. LA RESOLUTION DE LA STRUCTURE DE LA COLLAGENASE A ETE INITIEE LORS DE LA THESE DE DOCTORAT DE B. ARNOUX (1985) MAIS N'AVAIT PU ETRE MENEE A BIEN. LA POSITION DES DEUX MOLECULES DE L'UNITE ASYMETRIQUE AVAIT ETE DETERMINEE A 3 A DE RESOLUTION, MAIS LA STRUCTURE NECESSITAIT UNE RECONSTRUCTION IMPORTANTE AU NIVEAU DES BOUCLES. NOUS AVONS DU UTILISER DES METHODES NOUVELLES ET CLASSIQUES POUR AMORCER LA CONVERGENCE DE L'AFFINEMENT. PLUSIEURS RECONSTRUCTIONS MANUELLES SUR ECRAN GRAPHIQUE FURENT ENSUITE NECESSAIRES AVANT DE POUVOIR REINTERPRETER LA CARTE DE DENSITE ELECTRONIQUE. LE FACTEUR D'ACCORD R FINAL EST DE 18,3% SUR LA TOTALITE DES REFLEXIONS A 1,8 A DE RESOLUTION ET 295 MOLECULES D'EAU ONT ETE PLACEES DANS LA DENSITE ELECTRONIQUE. LES NOMBREUSES DIFFICULTES POUR RESOUDRE CETTE STRUCTURE ONT ETE INTERPRETEES A POSTERIORI PAR LA MAUVAISE QUALITE DES PHASES MIR (76) ET UN MODELE DE DEPART ERRONE (RMS=3 A) QUI ONT BLOQUE PENDANT LONGTEMPS LE PROCESSUS D'AFFINEMENT. LA COURBE DE LUZZATI MONTRE QUE L'ERREUR SUR LES POSITIONS ATOMIQUES DE LA STRUCTURE FINALE EST COMPRISE ENTRE 0,15 ET 0,25 A. LA COLLAGENASE D'HYPODERMA LINEATUM EST CONSTITUEE DE DEUX DOMAINES DE FEUILLETS ANTI-PARALLELES REPLIES EN TONNEAU. ELLE POSSEDE TROIS PONTS DISULFURE QUI STABILISENT LA STRUCTURE. LES DEUX MOLECULES DE L'UNITE ASYMETRIQUE SONT RELIEES ENTRE ELLES PAR UN PSEUDO AXE DE SYMETRIE NON CRISTALLOGRAPHIQUE D'ORDRE 2. L'ECART MOYEN SUR LA CHAINE PRINCIPALE EST DE 0,27 A. LA COLLAGENASE PRESENTE LA MEME STRUCTURE SECONDAIRE QUE LES AUTRES PROTEASES A SERINE. ELLE COUPE DES SUBSTRATS DE LA THROMBINE ET DE LA KALLIKREINE, BIEN QUE L'ENCOMBREMENT DE SA POCHE SPECIFIQUE SOIT SIMILAIRE A CELLE DE L'ELASTASE (VAL-216, VAL-226, SER-189). LA COLLAGENASE AYANT ETE CLONEE RECEMMENT, RENDANT POSSIBLE UNE ETUDE STRUCTURE/FONCTION POUR DETERMINER SA SPECIFICITE VIS-A-VIS DU COLLAGENE
Etudes structurales et fonctionnelles de la pompe d'efflux MexAB-OprM impliquée dans la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas aeruginosa by Laura Monlezun( )

2 editions published in 2012 in French and held by 3 WorldCat member libraries worldwide

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste impliqué dans les infections nosocomiales. Sa multi résistance aux antibiotiques s'exerce notamment grâce à l'activation de pompes d'efflux membranaires. Il s'agit de systèmes tripartites composés d'une porine de la famille OMF (Outer Membrane Factor) ancrée dans la membrane externe, d'un transporteur de la famille des RND (Resistance Nodulation Division) localisé dans la membrane interne et d'un adaptateur périplasmique de la famille des MFP (Membrane Fusion Protein) qui consolide l'ensemble. Le travail réalisé au cours de cette thèse apporte une contribution à la compréhension des mécanismes d'assemblage et d'ouverture des pompes d'efflux ainsi qu'à leur régulation grâce au développement de nouveaux outils empruntés à la physique, à la biochimie et à la microbiologie. Une première étude a permis de déterminer la stoechiométrie d'interaction entre MexA et OprM par gel bleu natif (Ferrandez, Monlezun et al. 2012). Une deuxième étude a été consacrée, dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de B. Le Pioufle (ENS Cachan), à la caractérisation par électrophysiologie de l'ouverture de la porine OprM, insérée dans une membrane artificielle reconstituée sur une biopuce (Wang, Monlezun et al. 2012). Puis, afin d'étudier cette fois ci, le mécanisme d'ouverture de la porine OprM in vivo, une étude fonctionnelle par complémentation chez Pseudomonas aeruginosa a été initiée. Enfin, dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de P. Plésiat (Laboratoire de Bactériologie, Besançon), deux analyses de mutants cliniques par modélisation ont été réalisées sur le régulateur MexZ de la pompe MexXY/OprM et de la porine d'influx des carbapénèmes OprD
Nouvelle approche dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques des bactéries colonisant les poumons des patients atteints de mucoviscidose : reconstitution d'une pompe d'efflux de Pseudomonas aeruginosa by Véronique Yvette Ntsogo Enguene( )

1 edition published in 2016 in French and held by 2 WorldCat member libraries worldwide

Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase
Functional investigation of the efflux pump MexA-MexB-OprM of Pseudomonas aeruginosa by Alice Verchère( )

1 edition published in 2014 in English and held by 2 WorldCat member libraries worldwide

Among the various mechanisms developed by the bacteria to counter to the effect of antibiotics, active efflux is on the front line. In Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacteria, efflux transporters are organized as multicomponent systems where MexB, the pump located in the inner membrane, works in conjunction with MexA, a periplasmic protein, and OprM, an outer membrane protein. MexB is a proton motive force-dependent pump with broad substrate specificity. During my PhD, I have designed an original activity assay for MexB and MexA. The pump is coreconstituted into proteoliposomes together with bacteriorhodopsin (BR), a light-activated proton pump. In this system, upon illumination with visible light, the photo-induced proton gradient created by the BR is shown to be coupled to the active transport of substrates through the pump. The activity of MexB is monitored indirectly. Since MexB uses the protomotive force to transport antibiotics, one can determine substrate transport though MexB by monitoring the pH inside the liposomes. For that purpose, pyranine, a fluorescent probe whose fluorescence yield increases with increasing pH, is encapsulated inside the liposomes. This test makes the investigation of the pump possible. In the absence of MexA, MexB has a basal activity which is not substrate-dependent. Once MexB is reconstituted together with MexA, its activity is specific and substrate-dependent. Then I worked on the reconstitution of the whole efflux pump. For this, I prepare two different kinds of liposomes: i) Liposomes with reconstituted MexA and MexB in which pyranine and a nucleic acid intercalating agent are encapsulated, ii) Liposomes with reconstituted OprM and encapsulated RNA. The activity of MexB is monitored thanks to the addition of EthB, a substrate of MexB, that is poorly fluorescent in aqueous medium and highly fluorescent when intercalated into RNA. Upon generation of a pH gradient, I observe two concomitant phenomena: the decrease of pyranine fluorescence, as MexB is using protons to transport the substrate, and the increase of the fluorescence of the RNA intercalating agent as a result of its interaction with RNA. I have successfully assembled the efflux pump and monitored transport through it from one liposome to the other. I have demonstrated that OprM needs to interact with MexA and MexB in order to open and that MexB activity is accelerated when the pump is assembled
Amphipol-Mediated Screening of Molecular Orthoses Specific for Membrane Protein Targets by Yann Ferrandez( )

1 edition published in 2014 in English and held by 2 WorldCat member libraries worldwide

Etude structurale du système Prolactine/Récepteur de la prolactine by Johannes Van Agthoven( Book )

2 editions published in 2010 in French and held by 2 WorldCat member libraries worldwide

Prolactin (PRL) is a pituitary hormone secreted by the hypothalamus. It's involved in a wide range of biological functions. The best known are growth and lactation. PRL induces its function upon interaction with a dimmer of its specific receptor (PRLR). Increasing experimental evidence on animal models shows that PRL might be involved in breast or prostate cancer. Several antagonists have been proposed, but their in vivo effects are weak. As we want to improve these antagonists, we are seeking to understand the activation mechanism of the PRLR by a structural approach. We solved the structure of PRL in complex with two extracellular domains of the rat PRLR (rECD). It enables to describe the site 2 interface between PRL and rECD 2, and the stem-stem interface between the two receptors. But the PRLR activation mechanism remains unclear. We therefore tried to produce a recombinant form of the full transmembrane PRLR in two expression system: \ecoli and \pichia. Pure samples of refolded PRLR have been obtained in a non-aggregated form. But its functionality has to be tested
Implication des porines dans la genèse et le développement des biofilms de Providencia stuartii by Mariam El khatib( )

1 edition published in 2017 in French and held by 2 WorldCat member libraries worldwide

Les biofilms, communautés multicellulaires bactériennes, sont omniprésents. Malgré leur importance pour l'écosystème, ils présentent une menace pour l'industrie autant que pour la santé humaine. La virulence des biofilms procède surtout de leur résistance élevée aux antibiotiques, qui rend leur éradication quasiment impossible. Ainsi, les biofilms sont impliqués dans la plupart des infections bactériennes chroniques, causant chaque année plus de 4000 décès en France. P. stuartii est une bactérie connue pour sa capacité à former des biofilms dans le tractus urinaire humain. Elle est responsable de 10% des INU chroniques et est décrite comme étant la plus résistante de son genre. Malgré ces faits, les études menées sur cette bactérie sont rares, freinant la compréhension du mécanisme de développement et de résistance de ses biofilms et compliquant ainsi l'avancement de nouvelles thérapies pour lutter, prévenir ou éradiquer ces infections. P. stuartii exprime au niveau de sa membrane externe deux porines, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, qui constituent 70% du contenu protéique membranaire. Ces porines sont le conduit principal permettant à la bactérie de communiquer et d'échanger avec son milieu environnant. Ainsi, les porines sont vitales pour la bactérie.A ce jour, trois publications sont disponibles qui traitent de ces deux porines, mais aucune n'a exploré leur influence sur la formation des biofilms bactériens. Les travaux effectués au cours de ma thèse ont ainsi visé à réduire le manque de connaissance sur les biofilms de P. stuartii et à dévoiler le rôle des porines dans l'établissement et la résistance de ces biofilms. Pour cela, nous avons segmenté notre travail en quatre parties ayant pour objectifs (1) de comprendre la formation des biofilms de P. stuartii et leur réponse aux stress du milieu environnant ; (2) de décrire l'effet de la suppression ou la surexpression des porines ; (3) d'étudier à l'échelle moléculaire et atomique le comportement des porines isolées ; et (4) de développer des outils pour étudier les porines à l'échelle moléculaire au sein d'un biofilm de P. stuartii
Residue 146 regulates prolactin receptor folding, basal activity and ligand-responsiveness: Potential implications in breast tumorigenesis( )

1 edition published in 2015 in English and held by 1 WorldCat member library worldwide

Highlights: A gain-of-function mutation at position 146 disentangled in the prolactin receptor. Structural integrity was altered in a mutation-specific manner. Structural alteration paralleled increased basal activity and ligand-insensitivity. Mutant expression did not affect two representative breast cancer cell lines. Abstract: PRLR I146L is the first identified gain-of-function variant of the prolactin receptor (PRLR) that was proposed to be associated with benign breast tumorigenesis. Structural investigations suggested this hydrophobic core position in the extracellular D2 domain to be linked to receptor dimerization. Here, we used a mutational approach to address how the conservative I-to-L substitution induced constitutive activity. Using cell-based assays of different I146-PRLR variants in combination with spectroscopic/nuclear magnetic resonance analyses we found that chemical manipulation of position 146 profoundly altered folding, PRL-responsiveness, and ligand-independent activity of the receptor in a mutation-specific manner. Together, these data further add to the critical role of position 146, showing it to also be crucial to structural integrity thereby imposing on the biological PRLR properties. When stably introduced in MCF-7 (luminal) and MDA-MB231 (mesenchymal) breast cancer cells, the most potent of the PRL-insensitive mutants (PRLR I146D) had minimal impact on cell proliferation and cell differentiation status
<> by Mathilde Belnou( )

1 edition published in 2017 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

The three-component multidrug MFS-type efflux pump EmrAB-TolC from Escherichia coli : from cloning to structural analysis by Narek Yousefian( )

1 edition published in 2020 in English and held by 1 WorldCat member library worldwide

Currently, due to the misuse of antibiotics, we are facing a major public health problem. The resistance to antibiotics of certain bacterial strains makes the treatment of infections very complex. In this context, the present thesis project concerns the study of a bacterial efflux complex capable of transporting antibiotics from the cytoplasm to the outside of the cell. This complex is composed of an inner-membrane Major Facilitator Superfamily (MFS) transporter (EmrB, E. coli multidrug resistance), a channel of the outer membrane TolC (Tolerance to Colicin E1) and a periplasmic adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance). Unlike RND-type efflux systems (such as AcrAB-TolC), little is known about the MFS-type EmrAB-TolC system. It is therefore important to study the entire complex on a structural and functional level, to analyse the marked differences between these two types of transport systems. The goal of my thesis project was to study at least one EmrAB-TolC complex from a structural point of view. For my studies the aim was to isolate the complex directly from bacteria overexpressing the three protein partners. In a first step, 15 homologous EmrAB-TolC systems were identified and their corresponding genes amplified from genomic DNA of different Gram-negative bacteria. Among the genes of the 15 systems, the genes coding for the E. coli and V. cholerae systems were further studied. The expression vectors encoded fluorescent markers for the monitoring of the expression levels of different proteins and for studying the formation of complexes. In a first step, the different protein expression levels (EmrB-mRFP1 and EmrA-sfGFP) were studied for several expression strains of E. coli by measuring the red and green fluorescence levels and by Western blot (anti-His, Myc, and Strep for EmrB, EmrA, and TolC). The E. coli strain C41(DE3) was best suited for co-expression of EmrAB-TolC. In a second step, the FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) methodology was used to identify a complex suitable for structural study. Thus this method enabled the observation that the EmrAB-TolC complex of E. coli was produced in higher amount than that of V. cholerae. The final co-purification protocol consists in perfoming a gentle lysis of the bacteria using lysozyme, then after solubilization with DDM, the purification is started by a Ni2+-NTA affinity chromatography step followed by a size exclusion chromatography step. Finally, the fractions containing the three protein partners are used for the detergent-exchange by amphipol A8-35 before the structural study by electron microscopy. Negative stain EM-micrographs displayed elongated objects with a length of 33 nm in side view. An average image of EmrAB-TolC shows similarities to that of the AcrAB-TolC complex observed under similar conditions. Similarities included the characteristic densities of TolC. Whereas differences were found in the lower part of EmrAB which is thinner than the lower part of AcrAB. The densities visible above the amphipol-ring correspond to EmrA, which displays a channel-like structure as in AcrA. The channel however seems to extend further towards the amphipol belt. Since EmrB does not have an extended periplasmic domain as the RND proteins have, these densities are therefore solely assigned to EmrA. EmrA, on the other side, contacts TolC akin to the interaction of AcrA/MexA to their cognate outer membrane channels (TolC/OprM) in a 'tip-to-tip' fashion
Structures et spécificités de Protéines Périplasmiques de Fixation pour les mannityl-opines chez Agrobacterium tumefaciens. by Loic Marty( )

1 edition published in 2016 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

L'agent pathogène Agrobacterium tumefaciens induit, chez les plantes, le développement de tumeurs dans lesquelles il prolifère, en intégrant un fragment de son plasmide Ti de virulence dans le génome de son hôte. Les tissus transformés synthétisent des composés originaux, appelés opines, qui sont utilisés comme nutriments spécifiques par la bactérie. Une vingtaine d'opines sont connues à ce jour, et chacune d'elle peut être métabolisée par des souches d'Agrobacterium tumefaciens possédant les gènes de transport et de catabolisme qui lui sont associés, ce qui apparait comme un avantage compétitif dans la colonisation de la tumeur. La présence de ces gènes dépend du type de plasmide Ti que la souche pathogène possède.Agrobacterium tumefaciens B6 possède un pTi de type octopine, qui porte les gènes de métabolisme des mannityl-opines, qui sont la mannopine, l'acide mannopinique, l'agropine et l'acide agropinique. La mannopine et l'acide mannopinique sont synthétisés par la même enzyme, et ont pour précurseurs respectivement la désoxy-fructosyl-glutamine (DFG) et le désoxy-fructosyl-glutamate (DFGA), tous deux opines de la famille de la chrysopine. La DFG est aussi un composé d'Amadori répandu et assimilable par de nombreux organismes. La mannopine sert de précurseur pour la synthèse de l'agropine. Enfin, la mannopine, l'acide mannopinique et l'agropine peuvent toutes trois se lactamiser spontanément en acide agropinique.Malgré la similarité chimique de ces quatre opines, chacune est transportée par une protéine périplasmique de fixation (PBP) associée à un transporteur ATP-binding Cassette (ABC) différent. La PBP sélectionne et fixe une opine pour l'apporter au transporteur ABC, qui permet le passage de l'opine dans le cytoplasme grâce à l'hydrolyse de deux molécules d'ATP. La spécificité du transporteur entier est déterminée par la PBP.Des études génétiques chez des souches possédant un pTi de type octopine ont montré que le système PBP-transporteur ABC AgaABCD est spécifique de l'acide agropinique, AgtABCD spécifique de l'agropine, MoaABCD spécifique de l'acide mannopinique et que MotABCD transporte la mannopine et également l'acide mannopinique. Chez la souche C58, qui ne possède pas un pTi de type octopine, le système de transport SocAB, codé par des gènes situés sur le plasmide cryptique At, transporte la DFG comme nutriment, et semble aussi capable d'importer la mannopine.Mon travail de thèse a permis, dans un premier temps, de caractériser les fortes affinités et la spécificité des PBP AgaA et AgtB pour l'acide agropinique, de la PBP MoaA pour l'acide mannopinique et de la PBP SocA pour la DFG, mais aussi la non spécificité de MotA pour la mannopine, l'acide mannopinique et la DFG, ce qui remet en question les affinités précédemment décrites pour AgtB et SocA. Dans un deuxième temps, ce travail a apporté les bases moléculaires et structurales des complexes PBP-mannityl-opines, complexes jamais caractérisés auparavant. Enfin, dans un troisième temps, la structure de la PBP AttC chez la souche C58, annotée comme mannopine-like, a été déterminée, et les expériences d'interaction ont montré qu'elle n'interagit avec aucune mannityl-opine, ce qui conduit à une révision de son annotation.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l'import des mannityl-opines chez Agrobacterium tumefaciens. Le fait qu'aucun des transporteurs étudié ne permette l'import de l'agropine laisse penser qu'il existe une autre PBP ou un autre système de transport encore inconnu assurant cette fonction, ouvrant la voie vers de nouvelles études sur les pTi de type octopine et agropine
Etude du système prolactine/récepteur à la prolactine by Anlia Hassani( Book )

1 edition published in 2010 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

Etude structurale et fonctionnelle de la régulation de la compétence et du processus de transformation chez Streptococcus pneumoniae by Dyana Sanchez( )

1 edition published in 2015 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

The natural genetic transformation contributes to the maintenance and the evolution of the genomes in bacteria; it is a key mechanism to adapt to their environment. It allows the integration of exogenous DNA into the bacterial chromosome by homologous recombination during a particular state called competence.My thesis focused on the regulation of the competence state in S. pneumoniae (ComD, ComE), and on the interactions between the proteins involved in the uptake, the processing and recombination of exogenous DNA (DprA, RecA). In this bacterium, the opening of the competence is under the control of the two-component system ComD-ComE, who induces the transcription of target genes. DprA is one of the protein induced during the competence state, it is very conserved into the bacterial kingdom, and is involved in the closure of competence via direct interaction with ComE. DprA is also a key transformation protein involved in processing the incoming DNA, protection against nucleases, and recruitment of the RecA recombinase. SAXS analysis of the ComD-ComE, resolution of the crystallographic structure of ComE REC domain study of the interactions between ComE and its promoter regions allowed us to understand the choreography of competence opening in S. pneumoniae. Meanwhile, we studied spDprA interactions with DNA and with RecA. These data allowed us to propose an interaction model between DprA and RecA in S. pneumoniae and to propose a mechanism for RecA's loading on the ssDNA by DprA. I focused too on H. pylori DprA participating on the resolution of the 3D structure of the C-terminal domain by NMR and studying its interaction with the dsDNA
Les vésicules extracellulaires : un outil de choix pour l'étude des protéines membranaires by Vincent Delauzun( )

1 edition published in 2020 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

Membrane proteins (MPs) present on the surface of living cells are part of a central class of the cell proteome. They are involved in many biological processes such as viral infections or cellular immune response. Producing these proteins for structural or functional studies is a difficult task because of their instability once extracted from their original membrane. Currently, most processes involve the purification of these proteins in a detergent and their stabilization in artificial environments. These costly and time-consuming methods do not always allow to preserve the natural architecture of these proteins.Eukaryotic cells have the ability to produce extracellular vesicles (EVs). They are made of a lipid bilayer comparable to a plasma membrane that contains MPs. They constitute true intercellular communication pathways and are currently the focus of much interest from the scientific community. In order to test the contribution of the use of EVs in the study of MPs, we have developed a process to rapidly obtain these over-expressed MPs on the surface of EVs produced from mammalian cells. This method has been first developed and validated on the glycoprotein of the Ebola virus envelope and then extended to other types of MPs such as the human CD73 enzyme. Finally, EVs have been used for the generation and selection of camelid antibodies against the Herpes virus envelope glycoprotein B.Based on all these results, EVs definitely seem to be an advantageous tool for obtaining, storing and using MPs in an environment as close as possible to their natural state
Patched, une nouvelle cible thérapeutique pour le cancer de la corticosurrénale by Anida Hasanovic( )

1 edition published in 2018 in English and held by 1 WorldCat member library worldwide

Nous avons récemment démontré que le récepteur du morphogène Hedgehog, Patched, qui est exprimé dans de nombreux cancers, est un transporteur de multiples drogues qui contribue à la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie. Le criblage d'une banque de molécules nous a permis d'identifier deux molécules qui inhibent l'activité d'efflux de doxorubicine de Patched. Nous avons montré que ces molécules renforcent les effets cytotoxiques, proapoptotiques, antiprolifératifs et anticlonogéniques de la doxorubicine sur les cellules de cancer de la glande surrénale (surrénalome) qui expriment de façon endogène Patched. De plus, nous avons observé que l'ajout de la molécule P375 au traitement à la doxorubicine inhibe le développement des tumeurs chez des souris ayant reçu une xénogreffe de cellules de surrénalome de façon plus significative que la doxorubicine seule. Nos résultats suggèrent que l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité d'efflux de drogues de Patched en association avec la doxorubicine est une option thérapeutique prometteuse pour le surrénalome, et très probablement pour d'autres cancers exprimant Patched. Nous avons découvert qu'une petite fraction seulement des cellules de la lignée de surrénalome exprime Patched au niveau de la membrane plasmique (cellules PM-Patched). Les cellules PM-Patched sont plus résistantes à la doxorubicine, et présentent une expression plus élevée de Patched mais aussi de la protéine ABCG2. ABCG2 étant un marqueur de cellules souches cancéreuses (CSC), nous pensons que les cellules PM-Patched pourraient être des CSC.D'autres expériences sont nécessaires pour valider cette hypothèse
Étude structurale et fonctionnelle d'une sérine/thréonine kinase de staphylococcus aureus by Patricia Paracuellos torrecilla( )

1 edition published in 2009 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

The phosphorylation /dephosphorylation reactions in bacteria regulate various cellular functions such as growth, differentiation, pathogenicity, antibiotic resistance, stress response, biofilm formation as well as several processes involved in secondary metabolism. However, detailed understanding of their complete signaling pathways induced by phosphorylation/dephosphorylation is still unclear. Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and a human pathogen. It is one of the primary causes of nosocomial infections and this opportunist pathogen is able to cause multiple infections ranging from furuncle to septicemia. This study is focused on the structural and functional characterizations of two proteins from this bacterium: the serine/threonine kinase Stk1 and one of its substrates, the triose phosphate isomerase. Stk1 has been previously identified as responsible for the phosphorylation of several enzymes involved in the central metabolism of this bacterium as well as virulence and resistance to the antibiotic phosphomycin. However, no structural characterization has been done to date. We have performed a crystallographic study of several domains of this protein. We now present the structure of three extracellular domains designated “PASTA” in addition to the 3D molecular model of the entire protein. PASTA domains are specific to bacterial Ser/Thr kinases and to Penicillin-Binding Proteins which are involved in the peptidoglycan synthesis. Thus, the structural knowledge of PASTA domains from Stk1 could be of particular interest in the rational drug-design of new inhibitors with therapeutic aims. Finally, we have demonstrated that triose phosphate isomerase activity is regulated by phosphorylation/dephosphorylation and we have described the reversible activation/inactivation mechanism
Le transporteur de médicaments anticancéreux, ABCG2, et son implication dans la chimiorésistance : étude structurale et mécanistique by Josiane Kassis( )

1 edition published in 2019 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

ABCG2 ou BCRP est une protéine membranaire de la famille des transporteurs ABC. Elle utilise l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour exporter des composés endogènes et exogènes hors des cellules. Elle participe ainsi à la protection et la détoxication de l'organisme. En revanche, dans le cas des cellules cancéreuses, elle est surexprimée et participe donc au phénotype de résistance à de multiples médicaments (MDR : Multi Drug Resistance). En effet, lors de la surexpression de cette protéine, les agents anti-cancéreux sont exportés hors des cellules tumorales, ce qui diminue leurs concentrations intracellulaires sous leurs seuils de cytotoxicité et les rend inefficaces. De par l'importance d'ABCG2 dans la chimiorésistance, de nombreux efforts sont effectués pour concevoir des inhibiteurs afin de restaurer la sensibilité des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, le projet de thèse vise à caractériser ABCG2 sur les plans structural et fonctionnel afin de comprendre son mécanisme d'action. La protéine ABCG2 exprimée chez E. coli, a été purifiée, sous forme stable et homogène et le rendement est de 1,5 mg de protéine par litre de culture. La caractérisation fonctionnelle de celle-ci témoigne de son repliement correct. En effet, il a été démontré qu'elle est capable de fixer différents substrats (naturels et agents anti-cancéreux) avec des affinités différentes. Des essais préliminaires de cristallisation ainsi que des observations par microscopie électronique révèlent des résultats encourageants pour la suite de la caractérisation structurale
Structure et fonction des toxines bactériennes à domaine FIC by Simon Veyron( )

1 edition published in 2017 in French and held by 1 WorldCat member library worldwide

Les protéines à domaine FIC (Filamentation induced by cAMP) sont très répandues chez les bactéries où elles catalysent l'ajout d'une modification post-traductionnelle contenant un phosphate à une protéine cible, en utilisant différents co-substrats comme l'ATP. Certaines de ces protéines sont des toxines sécrétées par des pathogènes humains, mais la fonction de la plupart d'entre elles reste mystérieuse. Plus d'une dizaine de structures de protéines FIC ont été déterminées récemment, qui ont permis d'élucider leur mécanisme catalytique. L'une des sous-familles de protéines FIC possède un glutamate dans leur site catalytique, dont il a été proposé qu'il aurait une fonction auto-inhibitrice pour la fixation de l'ATP. Durant ma thèse, j'ai étudié la structure et les mécanismes de régulation de deux familles de protéines FIC : les protéines FIC à glutamate inhibiteur, et la toxine AnkX de la bactérie pathogène Legionella pneumophila.La première étude s'est intéressée à la protéine FIC de la bactérie pathogène Enterococcus faecalis (EfFIC), qui fait partie de la sous-famille des protéines FIC possédant un glutamate inhibiteur. J'ai résolu plusieurs structures cristallographique d'EfFIC, qui ont permis de caractériser son site catalytique et comment elle fixe l'AMP et l'ADP. En utilisant une propriété fréquemment observée d'auto-AMPylation (modification par l'AMP), j'ai montré au moyen d'ATP radioactif qu'EfFIC possède une activité basale d'auto-AMPylation, et j'ai identifié une nouvelle activité de dé-AMPylation. En m'inspirant des métaux observés dans mes structures cristallographiques, j'ai montré que l'alternance entre les activités d'AMPylation et de de-AMPylation dépend de la nature du métal fixé dans le site actif et de la présence du glutamate. Ce glutamate régulateur est également présent chez une protéine humaine, HYPE, qui possède une double activité d'AMPylation et dé-AMPylation d' une chaperone du réticulum endoplasmique. Par un test de fluorescence, j'ai enfin montré que l'activité de HYPE était elle aussi régulée par les métaux comme celle de EfFIC. Ces résultats suggèrent un nouveau modèle de régulation partagé par des protéines FIC de la bactérie à l'homme.La seconde étude a porté sur la toxine AnkX de Legionella pneumophila, qui modifie les petites protéines G de la famille de Rab Rab1 et Rab35 (régulatrices du trafic cellulaire) par une molécule de phosphocholine (PC). En utilisant des liposomes de composition contrôlée, j'ai montré qu'AnkX interagit avec les membranes, et j'ai identifié par mutagenèse son domaine d'interaction avec les membranes. Au moyen de petites GTPases Rab ancrées artificiellement à la surface de liposomes par une queue 6his remplaçant le lipide naturel, j'ai montré que l'activité d'AnkX est stimulée par la présence de membranes. Des résultats préliminaires suggérent que Rab35 est un meilleur substrat que Rab1a, ce qui pourrait renseigner sur la fonction et le compartiment cellulaire où se trouve la toxine. J'ai ensuite mené une étude structurale d'AnkX par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), qui permet d'obtenir des informations structurales en solution. AnkX est constitué d'un domaine FIC, de répétitions ankyrine et d'un domaine C-terminal. L'analyse en SAXS montre que ces domaines s'organisent en forme de fer à cheval, suggérant un modèle d'association bi-partite du complexe AnkX/Rab aux membranes. L'ensemble de ces résultats conduit à un modèle dans lequel l'activité d'AnkX est régulée spatialement par les membranes, ce qui pourrait lui permettre de cibler à la fois les petites GTPases Rab cellulaires et le compartiment membranaire
 
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Alternative Names
Broutin-L'Hermite, Isabelle

Languages
French (19)

English (6)